محیط کشت چیست؟ شرایط و ویژگی های محیط کشت
محیط کشت چیست؟
محیط رشدی برای پاسخگویی به نیازهای تغذیه ای میکروب های خاص که برای فرآیندهای تکثیر و رشد ساخته شده اند. شرایط لازم برای یک محیط کشت خوب این است که می تواند مواد مغذی کافی را برای میکروب ها با توجه به نیازهای آنها، فضای اکسیژن یا گازهای دیگر و رطوبت مناسب را فراهم کند. ترکیب محیط کشت با توجه به توانایی باکتری ها یا میکروارگانیسم های دیگر برای استفاده از این عناصر مشخص می شود. چندین ویژگی محیط های کشت که برای رشد میکروبی مهم هستند عبارتند از مواد مغذی مانند کربن، نیتروژن، فسفات معدنی، گوگرد، مواد معدنی، آب و ویتامین ها.
مراحل کلیدی در محیط کشت
آماده سازی اولیه، محیط دهیراته برای بازجذب آب، استریل کردن، افزودن مکمل ها، پر کردن، برچسب زدن و عقیم سازی ثانویه. روشی که معمولاً برای جداسازی میکروارگانیسم ها در محیط های کشت استفاده می شود، روش رگه بندی است. کنترل کیفیت برای اطمینان از کیفیت و تعیین حداقل الزامات برای آماده سازی محیط های کشت برای آنالیز میکروبیولوژیکی و همچنین تعیین معیارها و روش های تست عملکرد محیط های کشت مورد استفاده قرار می گیرد.
کشت باکتری
یک روش ضروری برای مطالعه ویرولانس(توانایی بیماری‌زا یا میکروارگانیزم برای ایجاد آسیب به میزبان) و حساسیت به آنتی بیوتیک ها است. کشت همچنین اولین روش توسعه یافته برای مطالعه میکروبیوتای انسان با استفاده از محیط های مصنوعی است که امکان رشد و جداسازی باکتری ها را فراهم می کند. محیط های کشت محیط های رشد ساخته شده برای پاسخگویی به نیازهای تغذیه ای میکروب های خاص برای تولید مثل و رشد هستند.
انواع محیط کشت باکتری
محیط هایی که اغلب برای کشت باکتریایی استفاده می شوند شامل محیط های مایع و محیط های جامد هستند. در محیط های مایع، رشد میکروبی باعث می شود که محیط ها کدرتر به نظر برسند.در مورد فرآیند کشت در محیط های جامد، نمونه بر روی محیط کشت تلقیح می شود که سپس به عنوان کلنی (در باکتری ها و مخمر) یا به عنوان رشته قارچ رشد می کند. ویژگی های کلونی، مانند رنگ، شکل و اندازه، در تعیین نوع پاتوژن بسیار مفید هستند. نمونه های مورد استفاده می توانند از محیط مانند خاک، هوا، غذا یا از نمونه های بالینی مانند خون، بزاق، مدفوع و مایع مغزی نخاعی تهیه شوند. کشف محیط های کشت آغاز پیشرفت های سریع در میکروبیولوژی در قرن نوزدهم بود. در سال 1881، رابرت کخ رشد باکتریایی مطلوب را هنگام رشد در یک محیط کشت مایع متشکل از سرم گوشت گاو تازه یا عصاره گوشت نشان داد. با این حال، استفاده از محیط های کشت مایع، کشت خالص باکتریایی ایجاد نکرد. کخ با جایگزینی ژلاتین با آگار راهی برای ساخت محیط جامد پیدا کرد تا بتواند باکتری ها را جداسازی کند.
در سال 1887، جولیوس ریچارد پتری صفحه شیشه ای مسطح را که معمولاً برای محیط های کشت باکتری استفاده می شود با یک ظرف دایره ای جایگزین کرد و امروزه نیز استفاده می شود. این مورد اجازه می دهد تا کلنی را مشاهده کرده و آلودگی را کاهش دهد.
ویژگی و شرایط محیط کشت
لازم است به عناصری برای موفقیت آمیز بودن محیط های کشت شامل نوع مواد مغذی انتخاب شده، شرایط جوی، دما و مدت زمان نگهداری محیط کشت توجه شود. شرایط لازم برای یک محیط کشت خوب این است که می تواند مواد مغذی کافی را برای میکروب ها با توجه به نیازهای آنها، فضای اکسیژن یا گازهای دیگر و رطوبت مناسب را فراهم کند. علاوه بر این، برای کمک به رشد میکروبی، لازم است که تنظیم pH و دما مناسب بوده و با بار میکروبی (جمعیت اولیه میکروارگانیسم های زنده در یک فراورده) و آلودگی تداخل نداشته باشد. چندین ویژگی مهم محیط های کشت برای رشد میکروبی عبارتند از مواد مغذی مانند کربن، نیتروژن، فسفات غیر آلی، گوگرد، مواد معدنی غیر آلی، آب، ویتامین ها و این مواد به طور طبیعی در تزریق گوشت موجود هستند. عصاره گوشت گاو یا مخمر اغلب می تواند جایگزین تزریق گوشت در محیط های کشت شود. افزودن پپتون(محصول متابولیسم پروتئین) می تواند تامین کننده نیتروژن و کربن اضافی باشد.
دمای میکروب ها بهتر است سازگار باشد. به طور مثال ساز و کار رشد مطلوب باکتری ها و قارچ های مزوفیل دمای 40-25 درجه سانتی گراد، باکتری های ترموفیل دمای بالای 45 درجه سانتی گراد و سایکروفیل به دمای زیر 20 درجه سانتی گراد می باشد. پاتوژن ها در بدن انسان به طور کلی مزوفیل هستند.
ساخت محیط های کشت
مراحل کلیدی در محیط کشت عبارتند از: آماده سازی اولیه، محیط دهیراته برای بازجذب آب، استریل کردن، افزودن مکمل ها، پر کردن، برچسب زدن و عقیم سازی ثانویه.
آماده سازی اولیه
بهتر است برای آماده سازی مایع / محیط کشت مایع ، مایع را قبل از استریل کردن می توان در ظرف مورد نیاز (معمولا یک بطری شیشه ای) بریزید. استفاده از ابزار دقیق در این فرایند ضروری است. کنترل کیفیت باید با بررسی منظم حجم خارج شده، با اندازه گیری حجم یا با تأیید وزن انجام شود. برای آماده سازی پلیت های کشت، به طور کلی باید استریل، سرد و سپس در یک پتری دیش ریخته شود. محتویات حجم پلیت باید در هنگام ریختن در نظر گرفته شود.
محیط دهیراته برای بازجذب آب
آماده سازی محیط های کشت به مولفه هایی نیاز دارد که باید حل شوند. محیط کشت پودر با مخلوط کردن تعدادی از محیط ها به حجم مورد نیاز آب، دوباره هیدراته می شود. آب مورد استفاده باید تازه باشد و برخی از محیط ها نیاز به آب گرم دارند. حفظ همگن بودن محلول با مخلوط کردن آن مهم است. برای محیط حاوی آگار به عنوان یک عامل جامد کننده، آبرسانی مجدد توسط حرارت ملایم و هم زدن مخلوط آب با محیط برای حل کردن آن انجام می شود. در این فرآیند، محیط ها باید در دمای 100-95 درجه سانتی گراد نگه داشته شوند و فقط باید برای مدت کوتاهی (کمتر از 1 دقیقه) بجوشد تا از سوختن محیط ها جلوگیری کند.
استریل کردن
بیشتر محیط ها توسط اتوکلاو کردن یا در یک آگار آماده شده برای پلیت های چند محیط استریل می شوند. برای برخی از کشت های خاص، عقیم سازی محیط توسط فیلتراسیون انجام می شود.
افزودن مکمل ها
به محیط باید پس از فرایند استریل کردن انجام شود، زمانی که محیط در یک حمام آب(بن ماری) با دمای پایین تر قرار می گیرد.
پر کردن
در محیط های آگار، موادی که استریل شده اند، باید در یک پتری دیش ریخته شوند. فرایند انتقال باید بسیار با دقت انجام گردد تا از آلودگی جلوگیری شود. برای آماده سازی پر کردن پتری دیش ، محیط استریل شده باید با دقت در حالت مایع (تا زمانی که درجه حرارت به حدود 45-50 سانتی گراد برسد) گرم شود و تشکیل ژل معمولا بین 32 تا 40 سانتی گراد رخ می دهد و سپس در پتری دیش گرم ریخته می شود. پتری دیش ها استریل معمولا قطر 95-100 میلی متر یا 50-55 میلی متر دارند. محیط آگار اغلب به طور مساوی توزیع نمی شود زیرا ذوب می شود و برای اطمینان از توزیع یکنواخت نیاز به مخلوط کردن دارد. پر کردن می توان به صورت نیمه خودکار با استفاده از دیش پرکننده انجام می شود. لازم است به صورت دوره ای بر کنترل کیفیت حجم پر شده نظارت شود. نظارت معمولاً با وزن کردن پلیت پر شده انجام می شود. پر کردن پلیت ها باید تحت جریان هوای یک طرفه انجام شود تا آلودگی به حداقل برسد. هنوز هم لازم است از آلودگی جلوگیری شود حتی اگر عقیم سازی ثانویه برنامه ریزی شده باشد، مانند شرایط پس از تابش.
تصویرسازی از مراحل ساخت محیط کشت
جداسازی میکروارگانیسم ها در محیط های کشت
تلاشی برای رشد میکروارگانیسم ها در خارج از محیط طبیعی آنها است. روشی که معمولاً برای جداسازی میکروارگانیسم ها در محیط های کشت استفاده می شود، روش کشت خطی است. این روش از یک صفحه آگار مواد مغذی استریل استفاده می کند. یک نمونه رقیق از کشت مخلوط با یک حلقه استریل گرفته می شود و یک سری خط در یک منطقه از پلیت ایجاد می شود. در مرحله بعد، لوپ استریل گرم می شود و سپس با ناحیه اول تماس داشته و یک رگه در ناحیه دوم ایجاد می شود که برخی از سلول ها را از ناحیه اول انتقال می یابند. لوپ ها همیشه باید قبل از تماس با اینکولوم استریل/گرم شوند. به طور مشابه، رگه ها در مناطق سوم و چهارم ایجاد می شوند، در نتیجه سلول ها را جدا می کنند و می توانند به کلنی های منفرد تبدیل شوند. پس از 24-48 ساعت نگهداری، کلنی های گسسته در صفحه ظاهر می شوند.
منابع
- Pommerville JC. Fundamentals of Microbiology. 12th ed. Burlington, MA: Jones & Bartlett Learning; 2022.
- Austin B. The value of cultures to modern microbiology. Antonie Van Leeuwenhoek. 2017;
- Difco & BBL. Difco & BBL Manual: Manual of Microbiological Culture Media. 2nd editio. Zimbro M, Power D, Miller S, Wilson G, Johnson J, editors. Sparks, MD: Becton, Dickinson and Company;
- American Type Culture Collection. Bacteriology Culture Guide [Internet]. American Type Culture Collection. 2021 [cited 2022 Mar 5]. p. 28. Available from: https://www.atcc.org/resources/cultureguides/bacteriology-culture-guide
- Mobed A, Baradaran B, Guardia M de la, Agazadeh M, Hasanzadeh M, Rezaee MA, et al. Advances in detection of fastidious bacteria: From microscopic observation to molecular biosensors. TrAC – Trends Anal Chem [Internet]. 2019;113:157–71. Available from: https://doi.org/10.1016/j.trac.2019.02.012
- Atlas R, Snyder J. Reagents, Stains, and Media: Bacteriology. In: Jorgensen JH, Pfaller MA, editors. Manual of Clinical Microbiology. 11th editi. Washington, DC: ASM Press; 2015. p. 316–49.
- Das N, Triparthi N, Basu S, Bose C, Maitra S, Khurana S. Progress in the development of gelling agents for improved culturability of microorganisms. Front Microbiol. 2015;6(JUN):1–7.
- Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA. Medical Microbiology. 9th ed. Philadelpia: Elsevier Inc.; 2021.
- Brown A, Smith H. Benson’s Microbiological Applications: Laboratory Manual in General Microbiology. 13th ed. New York: McGraw-Hill Education; 2015.
- American Type Culture Collection. Introduction To Microbiology [Internet]. American Type Culture Collection. 2021 [cited 2022 Mar 5]. p. 40. Available from: https://www.atcc.org/resources/cultureguides/introduction-to-microbiology
- Sandle T. Pharmaceutical Microbiology: Essentials for Quality Assurance and Quality Control.
