کاریوتایپ روشی برای بررسی ناهنجاری های کروموزومی
کاریوتایپ روشی برای بررسی ناهنجاری های کروموزومی
کاریوتایپ فرآیند جفت شدن و مرتب کردن تمام کروموزوم های یک ارگانیسم است، بنابراین یک تصویر ژنومی از کروموزوم‌های یک فرد ارائه می کند. کاریوتایپ‌ها با استفاده از روش های رنگ آمیزی استاندارد شده تهیه می شوند که ویژگی های ساختاری مشخصه را برای هر کروموزوم نشان می دهند. سیتوژنتیک بالینی، کاریوتایپ‌های انسانی را برای تشخیص تغییرات ژنتیکی فاحش و ناهنجاری هایی که چندین مگا باز یا بیشتر از DNA را شامل می شود، تجزیه و تحلیل می کند. کاریوتایپ ها میتوانند تغییرات در تعداد کروموزوم های مرتبط با اختلالات آنیوپلوئیدی مانند تریزومی (21سندرم داون) را نشان دهند. تجزیه و تحلیل دقیق کاریوتایپ ها همچنین می تواند تغییرات ساختاری ظریف‌تری مانند حذف‌های کروموزومی، تکرارها، جابجایی‌ها یا وارونگی‌ها را مشخص کند. در واقع، همانطور که ژنتیک پزشکی به طور فزاینده‌ای با پزشکی بالینی ادغام می شود، کاریوتایپ‌ها به منبع اطلاعات برای تشخیص نقایص خاص مادرزادی، اختلالات ژنتیکی و حتی سرطان تبدیل می شوند.
تهیه کاریوتیپ از سلول‌های میتوزی
کاریوتایپ ها از سلول‌های میتوزی تهیه می شوند که در بخش متافاز یا پرومتافاز چرخه سلولی متوقف شده اند (زمانی که کروموزوم‌ها متراکم‌ترین ترکیبات خود را به خود میگیرند.) انواع بافت‌ها را می توان به عنوان منبع این سلول‌ها استفاده کرد. برای تشخیص سرطان، نمونه‌های معمولی شامل بیوپسی تومور یا نمونه‌های مغز استخوان استفاده می شود. برای سایر تشخیص‌ها، اغلب از نمونه‌های خون محیطی یا بیوپسی پوست استفاده می شود.
تشخیص پیش از تولد
برای تشخیص پیش از تولد، مایع آمنیوتیک یا نمونه های پرز کوریونی ( cvs) به عنوان منبع سلول مورد استفاده قرار می گیرند.
کاریوگرام ویلابرا |welabra.com
فرآیند تولید کاریوتایپ
فرآیند تولید کاریوتایپ با کشت کوتاه‌مدت سلول‌های مشتق شده از یک نمونه آغاز می شود. پس از یک دوره رشد و تکثیر سلولی، تقسیم سلول ها در متافاز با افزودن کلشی‌سین متوقف می گردد. کلشی‌سین تقسیم میتوز را در مرحله متافازی متوقف می کند.
زیرا بهترین مرحله برای مشاهده کاریوتایپ مرحله متافازی است
سلول‌ها در مرحله بعدی با محلول هیپوتونیک تیمار می شوند که باعث می شود هسته‌هایشان متورم شده، سلول‌ها ترکیده و کروموزوم‌ها از هم جدا شوند، سپس هسته‌ها با یک تثبیت کننده شیمیایی تیمار می شوند، روی یک لام شیشه‌ای قرار می گیرند و با لکه‌های مختلفی که ویژگی‌های ساختاری کروموزوم ها را نشان می دهند، مشخص می گردند. الگوهای نواری جزئیات ساختاری کروموزوم‌ها را آشکار می کند.
بدون هیچ پردازشی، جزئیات ساختاری کروموزوم‌ها در زیر میکروسکوپ نوری به سختی قابل تشخیص است؛ بنابراین، برای مؤثرتر و کارآمدتر کردن آنالیز، سیتولوژیست‌ها لکه رنگ‌هایی را ایجاد کرده اند که به DNA متصل می شوند و الگوهای نواری مشخصی را برای کروموزوم‌های مختلف ایجاد می کنند. قبل از توسعه این تکنیک‌های نواربندی، تشخیص کروموزوم‌ها از یکدیگر بسیار مشکل بود و کروموزوم‌ها بر اساس اندازه و محل قرارگیری سانترومرشان گروه بندی می شدند.
این روش در سال 1970 تغییر کرد، زمانی که Torbjorn Caspersson و همکارانش اولین تکنیک باندینگ را که به نام Q-bandingشناخته میشود، توصیف کردند. Q-banding شامل استفاده از رنگ فلورسنت کویناکرین است که DNA را alkylate می کند و به مرور زمان خاموش می شود.
Caspersson و همکاران نشان دادند که کویناکرین الگوهای نواری مشخص و قابل تکرار را برای کروموزوم های فردی تولید می کند. از آن زمان، محققان انواع دیگری از تکنیک‌های باندینگ کروموزوم را توسعه داده‌اند که تا حد زیادی جایگزین Q-banding در سیتوژنتیک بالینی شده‌اند.
امروزه اکثر کاریوتایپ ها با رنگ گیمسا رنگ آمیزی می شوند که وضوح بهتری از نوارهای جداگانه را ارائه می دهد، آماده سازی پایدارتری ایجاد می کند و می تواند با میکروسکوپ نوری (زمینه روشن) تجزیه و تحلیل شود.
در ادامه با انواع روش های باندینگ در کاریوتایپ آشنا می شویم.
کاریوتایپ با باندینگ Q (Quinacrine- banding)
Q باندینگ از رنگ آمیزی کویناکرین (کویناکرین دی هیدروکلراید) استفاده می کند و ساده‌ترین و اولین روش باندبندی کروموزومی است. کروموزوم‌های رنگ آمیزی کویناکرین الگوی مشخصی از نوارهای روشن را در زمینه تیره‌تر نشان می‌دهند. از آنجایی که کویناکرین ترکیب فلورسنت است، نوارها تنها زمانی ظاهر میشوند که کروموزوم ها در معرض نور فرابنفش( UV) قرار گیرند. نور فرابنفش باعث درخشش مولکول‌های کویناکرین می شود، بنابراین نواحی هتروکروماتین فلورسانس‌دار شده و در زیر میکروسکوپ فلورسنت به صورت درخشان ظاهر می شود در حالی که قسمت‌های دیگر تاریک باقی می مانند.
این الگوی نواری روشن و تاریک بسیار قابل تکرار است و همچنین برای هر کروموزوم اختصاصی است، بنابراین با استفاده از باند کویناکرین برای شناسایی کروموزوم‌های خاص در یک سلول و همچنین برای تعیین اینکه آیا کروموزوم از نظر ساختاری طبیعی است یا غیرطبیعی استفاده می شود. کویناکرین یک عامل بینابینی است و بین جفت‌های باز مارپیچ DNA قرار می گیرد.
کویناکرین تمایل بیشتری به توالی حاوی AT دارد، بنابراین فلورسانس کویناکرین در طول توالی غنی از AT افزایش می‌یابد و نسبت به توالی غنی از GC روشن به نظر می رسد.
کویناکرین سرطانزا است!
باندینگ G (Giemsa-banding)
G-banding رایج‌ترین تکنیک مورد استفاده برای رنگ‌آمیزی کروموزوم در سیتوژنتیک است. در این روش رنگ‌آمیزی کروموزوم‌ها، ابتدا آنها با تریپسین تیمار می شوند. تریپسین تا حدی برخی از پروتئین‌های کروموزومی را هضم می کند، در نتیجه ساختار کروماتین را ضعیف می کند و به رنگ گیمسا اجازه می دهد به DNA دسترسی پیدا کند تا الگوی مشخص و قابل تکراری از نوارهای تیره و روشن نمایان شود. به‌طور کلی، مناطق هتروکروماتیک DNA که غنی از AT هستند، در G-banding تیره‌تر می شوند و در مقابل مناطق غنی از GC که از نظر رونویسی فعال‌ترند، روشن‌تر دیده می شوند.
نمونه‌ای از کروموزوم‌های انسانی رنگ‌آمیزی شده با گیمسا، همانطور که در زیر میکروسکوپ ظاهر می شوند. به طور معمول، نواربندی G بین 400 تا 800 نوار با کیفیت بالا را در بین 23 جفت کروموزوم انسانی ایجاد می کند. هرکدام از این نوارها به طور متوسط معادل 6000 تا 8000 kb از DNA هستند.
در این روش ابتدا تقسیم سلولی با معرفی مثل متوتروکسات یا تیمیدین مهار می شود. سپس با اضافه کردن اسیدفولیک یا دئوکسی سیتیدین به محیط کشت، سلول‌ها وارد تقسیم میتوز می شوند. در ادامه کلشی‌سین در زمانی که تعداد بیشتری از سلول‌ها در مرحله پرومتافاز می‌باشند و کروموزوم‌ها به طور کامل متراکم نشدند، اضافه میشود، بنابراین الگوی نواربندی دقیق‌تری به دست می آید.
باندینگ C (Centromeric- heterochromatin)
در این روش کاریوتایپ، قبل از استفاده از رنگ آمیزی گیمسا، سلول با هیدروکسید باریم پیش تیمار می شود، بنابراین این تکنیک به رنگ آمیزی (CBG (C-banding by base with Giemsa نیز معروف است. DNA به طور انتخابی با هیدروکسید باریم دپورینه شده و دو رشته از هم باز می شوند، سپس با انکوبه کردن در محلول نمکی گرم، قطعات حاصل شسته می شوند.
هتروکروماتین در برابر تجزیه مقاوم باقی مانده و بنابراین تنها بخشی است که به رنگ گیمسا متصل می شود.
درنتیجه کروموزوم ها به صورت محو و شبح مانند دیده میشوند که اطراف سانترومر در نواحی پلیمورفیک پریسانترومری کروموزوم‌های 1 ، 9 ، 16 در انتهای بازوی بلند Y به شدت رنگ گرفته و تیره هستند. نواربندی C برای تعیین کروموزوم‌های دیسانتریک، دیسانتریک کاذب و نیز مطالعه کروموزوم‌های مارکر و انواع پلیمورفیسم مفید است.
باندینگ R (Reverse-banding)
در این تکنیک الگوی نوار تولید شده در کروموزوم، مخالف نواربندی G و Q است. یعنی نوار تاریک (منطقه غنی از (AT) مشاهده شده در روش G-banding ، در R-banding روشن و یوکرماتینی به نظر می رسد و بالعکس.
این تکنیک به دو روش فلورسنت و غیر فلورسنت انجام می شود.
روش R-banding نیز از رنگ‌آمیزی گیمسا استفاده می کند، اما قبل از رنگ آمیزی با گیمسا، لام در دمای 88 درجه سانتی‌گراد در محلول بافر حرارت داده می شود. گرما باعث دناتوره شدن DNA می شود.
G-banding معمولاً به R-banding ترجیح داده می شود، با این حال در برخی موارد R-banding یک مکمل مفید برای G-banding است، زیرا برخی از G باند‌های کوچک توسط R-banding تشخیص داده می شوند.
باندینگ T (Telomeric-banding)
نواربندی T نوعی نواربندی R است که در آن فقط نواحی انتهایی کروموزوم‌ها یا تلومرها رنگ می گیرند. تیمار شدیدتر کروموزوم‌ها، رنگ پذیری را به جز در نواحی تلومر که مقاوم به حرارت هستند کاهش می دهد. تکنیک‌های نواربندی T به صورت فلورسنت و غیرفلورسنت هستند.
باندینگ NOR (Nucleolar organizing regions)
نواربندی NOR تنها مناطقی را رنگ میک ند که به عنوان سازمان دهنده هسته‌ای ( NORs ) در ساقه ماهواره‌ای کروموزوم‌های آکروسانتریک فعالیت دارند. این نواحی حاوی ژن‌های RNA ریبوزومی هستند و با نیترات نقره رنگ می گیرند.
سازماندهی کروموزوم ها در کاریوگرام
به منظور به حداکثر رساندن اطلاعات تشخیصی به دست آمده از کروموزوم، تصاویر کروموزوم‌های منفرد در قالب استاندارد شده‌ای به نام کاریوتایپ یا به طور دقیق‌تر، کاریوگرام مرتب می شوند.
طبق کنوانسیون‌های بین المللی، اتوزوم‌های انسان یا کروموزوم‌های غیرجنسی به ترتیب نزولی بر حسب اندازه از 1 تا 22 شماره‌گذاری می شوند، به استثنای کروموزوم‌های 21 و 22 که اولی در واقع کوچک‌ترین اتوزوم است. کروموزوم‌های جنسی معمولاً در انتهای کاریوگرام قرار می گیرند.
در کاریوگرام، کروموزوم‌ها در امتداد یک محور افقی که با سانترومرهای آنها مشترک است، همسو می شوند. از محل قرارگیری سانترومر همچنین میتوان برای شناسایی مورفولوژی یا شکل ناخالص کروموزوم‌ها استفاده کرد.
به عنوان مثال، کروموزوم‌های متاسانتریک، مانند کروموزوم‌های 1 ، 3 ، 16 دارای بازوهای p و q با طول تقریباً مساوی هستند. کروموزوم‌های ساب متاسانتریک، مانند کروموزوم‌های 2 ، 6 ، 10 دارای سانترومرهایی هستند که کمی از مرکز جابجا شده‌اند. کروموزوم‌های آکروسانتریک مانند کروموزوم‌های 14 ، 15 ، 21 دارای سانترومرهایی هستند که در نزدیکی انتهای خود قرار دارند.
مرتب کردن کروموزوم‌ها در کاریوگرام می تواند شناسایی هر گونه ناهنجاری را ساده کند. توجه داشته باشید که الگوهای نواری بین دو نسخه کروموزوم یا همولوگ هر اتوزوم تقریباً یکسان است. برخی از تفاوت‌های ظریف بین همولوگ‌های یک کروموزوم معین را می توان به تنوع ساختاری طبیعی در بین افراد نسبت داد.
استفاده از کاریوتایپ یا کاریوگرام برای تشخیص ناهنجاری های کروموزومی
امروزه کاریوگرام باند G به طور معمول برای تشخیص طیف گسترده‌ای از ناهنجاری‌های کروموزومی در افراد استفاده می شود. اگرچه وضوح تغییرات کروموزومی قابل تشخیص با کاریوتایپ معمولاً چند مگاباس است، این مقدار می تواند برای تشخیص دسته‌های خاصی از ناهنجاری‌ها کافی باشد.
به عنوان مثال، آنیوپلوئیدی که اغلب به دلیل عدم وجود یا اضافه شدن یک کروموزوم ایجاد می شود، با تجزیه و تحلیل کاریوتیپ به راحتی قابل تشخیص است.
سیتوژنتیک‌ها همچنین اغلب می توانند حذف‌ها یا درجه‌ای بسیار ظریف‌تر را به عنوان انحراف از الگوهای نواری طبیعی تشخیص دهند. به همین ترتیب، جابه جایی‌ها اغلب بر روی کاریوتیپ‌ها به راحتی آشکار می شوند. هنگامی که تغییرات منطقه‌ای در کروموزوم‌ها روی کاریوتیپ‌ها مشاهده می شود، محققان اغلب علاقه‌مند به شناسایی ژن‌های کاندیدا در بازه بحرانی هستند که بیان نادرست آنها ممکن است باعث ایجاد علائم در بیماران شود. این فرآیند جستجو با تکمیل پروژه ژنوم انسانی که نوار های سیتوژنتیکی را با اطلاعات توالی DNA مرتبط می کند، بسیار تسهیل شده است. در نتیجه، محققان اکنون قادر اند طیف وسیعی از تکنیک‌های سیتوژنتیک مولکولی را برای دستیابی به وضوح بالاتر تغییرات ژنومی به کار ببرند. هیبریداسیون درجا فلورسانس (FISH) و هیبریداسیون ژنومی مقایسه ای (CGH) نمونه‌هایی از دو رویکرد هستند که به طور بالقوه می توانند ناهنجاری‌ها را در سطح ژن‌های فردی شناسایی کنند. اگرچه کاریوتایپ، بسیاری از بیماری‌های ژنتیکی را شناسایی میکند، اما ممکن است به تنهایی مفید واقع نشود و مراجعه به متخصص ژنتیک امری واجب و ضروری است.
