اهمیت رتیکولوسیت (گلبول قرمز نابالغ) در آزمایشگاه

رتیکولوسیت‌ها (reticulocyte) گلبول‌های قرمز نابالغی هستند که در مغز استخوان تولید، در خون محیطی آزاد و به مدت 1 الی 2 روز به گلبول‌های قرمز بالغ تبدیل می شوند. افزایش یا کاهش تعداد رتیکولوسیت‌ها (reticulocyte) می تواند نشان دهنده‌ی فعالیت اریتروپوئز یا نارسایی آن نسبت به آنمی (کم خونی) و اختلال عملکرد مغز استخوان باشد.

فلوسایتومتری رتیکولوسیت (گلبول قرمز نابالغ)

فلوسایتومتری معمول‌ترین روش شمارش رتیکولوسیت‌ها (reticulocyte) با سرعت و دقت بالا می‌باشد؛ اولین قدم در این فرایند، رنگ آمیزی رتیکولوسیت (گلبول قرمز نابالغ) با مخلوط کردن محلول نارنجی تیازول با خون است. این محلول در محیط تاریک نگهداری، در دمای اتاق کشت و سپس از طریق دستگاه لیزر اجرا می شود. این رنگ به RNA (ریبونوکلئیک اسید) ریبوزومی (rRNA) می چسبد که امکان تمایز مرحله به مرحله در رتیکولوسیت (گلبول قرمز نابالغ) را فراهم می کند. سلول‌های جدید دارای محتوای RNA بیشتری نسبت به رتیکولوسیت‌های بالغ تر با محتوای RNA (ریبونوکلئیک اسید) کم هستند. تعداد رتیکولوسیت تعیین شده درصد رتیکولوسیت‌ها در کل مقدار گلبول‌های قرمز در محیط خون خواهد بود.

ساختار گلبول قرمز نابالغ

رتیکولوسیت (reticulocyte) با تبدیل شدن به یک گلبول قرمز بالغ، دچار تغییرات ساختاری متعددی می شود. این فرایند در داخل مغز استخوان (در جایی که کروماتین و تراکم هسته‌ی اریتروبلاست دچار تغییر شده) آغاز می‌شود. این فرایند هنگام تعامل انوکلئیناسیون با ماکروفاژها صورت گیرد و یک رتیکولوسیت (گلبول قرمز نابالغ) تشکیل شود. تجزیه و از بیرون راندن اندامک‌ها در مغز استخوان آغاز شده و زمانی که رتیکولوسیت (reticulocyte) در جریان خون است ادامه می یابد؛ شامل شبکه اندوپلاسمی، دستگاه گلژی، لیزوزوم، میتوکندری, و ریبوزوم‌ها از طریق فرایند‌های اتوفاژی و غیر اتوفاژی. تجزیه RNA در جریان خون توسط ریبونوکلئازها تسهیل می شود. برخی rRNA برای تشکیل گلبول قرمز باقی می ماند. تغییرات در حجم سلول و بازسازی غشاء از طریق اگزوزوم رخ می‌دهد. همه این تغییرات به صورت انتخابی رخ می‌دهد، بنابراین پروتئین‌های لازم در طول زندگی یک رتیکولوسیت (گلبول قرمز نابالغ) در دسترس هستند، اما می‌توانند در صورت لزوم برای ایجاد گلبول قرمز بالغ دوجداره بیرون رانده شوند.

در مقایسه با گلبول قرمز بالغ، رتیکولوسیت‌ها (reticulocyte) حجم بیشتری دارند، میزان هموگلوبین بالاتر و غلظت هموگلوبین کمتری دارند.  رتیکولوسیت‌ها (گلبول قرمز نابالغ) فقط می توانند هموگلوبین را در مغز استخوان سنتز کنند. بنابراین، هنگامی که آنها وارد خون محیطی می‌شوند، دارای حداکثر مقدار هموگلوبین می‌باشند.

عملکرد گلبول قرمز نابالغ

یک رتیکولوسیت (reticulocyte) گامی در فرایند اریتروپوئز می‌باشد. این ماده از یک سلول بنیادی خون  ساز تمایز یافته تشکیل می‌شود. رتیکولوسیت‌ها (گلبول قرمز نابالغ) در مغز استخوان تشکیل می‌شوند، جایی که آنها به مدت 1 تا 3 روز به رشد خود ادامه می‌دهند. سپس به جریان خون با طول عمر 1 تا 2 روز قبل از تبدیل شدن به گلبول‌های های بالغ آزاد می شوند. در طول این مدت، رتیکولوسیت (گلبول قرمز نابالغ) دچار تغییرات زیادی می‌شود تا به یک گلبول قرمز با عملکرد بالغ تبدیل شود. افزایش سطح اریتروپویتین (EPO) مغز استخوان را برای افزایش تولید رتیکولوسیت (گلبول قرمز نابالغ) تحریک می‌کند. سطح اریتروپویتین به طور معمول 3 تا 4 روز قبل از افزایش تعداد رتیکولوسیت (reticulocyte) افزایش می‌یابد.

رتیکولوسیت در میکروسکوپ نوری

در میکروسکوپ نوری، نمونه ابتدا باید رنگ آمیزی شود، معمولا با استفاده از متیلن آبی جدید یا کریسیل آبی درخشان، که به RNA متصل می شود. رنگ اجازه می‌دهد تا سلول‌ها توسط رسوب درون سیتوپلاسمی آبی شناخته شوند, از ظاهر گرانول‌ها تا شبکه‌ای از مواد رتیکولار متغیر است. با قسمت‌های مساوی از کل خون مخلوط شده و در دمای اتاق کشت داده می‌شود. آماده سازی محیط کشت‌ها با یک رنگ مخالف درآزمایش رایت که به روشن شدن تمایز رتیکولوسیت‌ها (گلبول قرمز نابالغ) با پس زمینه کمک می‌کند. تستر به صورت دستی رتیکولوسیت‌ها (reticulocyte) را در زیر میکروسکوپ الکترونی می‌شمارد.

اندازه گیری شمارش رتیکولوسیت (گلبول قرمز نابالغ) با میکروسکوپ نوری دیگر معمولاً مورد استفاده قرار نمی‌گیرد. همچنین قابلیت تکثیر پایینی داشته و می‌تواند با ضریب تغییرات بین 25 تا 48%. غیرقابل اعتماد باشد.

نمای هیستولوژی ( بافت شناسی ) رتیکولوسیت

رتیکولوسیت در میکروسکوپ الکترونی

میکروسکوپ الکترونی دید جزئی تری نسبت به رتیکولوسیت‌های (reticulocyte) فرد داده و اجازه می‌دهد تا تغییرات سازمان یافته‌ای در طول عمر خود انجام دهند. آماده سازی سلول با تثبیت در محلول گلوتارآلدئید/تانیک اسید در سدیم کاکودیلات و به دنبال آن تجدید حیات در 2.0% آگار است. محیط کشت‌های آگار به طور مناسب شسته می‌شوند و سپس با 1.5% اورانیل استات در 50% متانول و سیترات سرب رنگ آمیزی می‌شوند.

در مرحله آغاز رتیکولوسیت‌ها (reticulocyte) ، می‌توان میتوکندری‌ها (از جمله سنتز هم) ، بسیاری از ریبوزوم‌ها، وزیکول‌های برون سلولی، وزیکول‌های درون سلولی و حفره‌های پوشیده شده با کلاترین را مشاهده کرد. میکروسکوپ همچنین میزان دقیق‌تری از ترکیب آهن را در مراحل اولیه رتیکولوسیت‌ها (گلبول قرمز نابالغ) نشان می‌دهد. در رتیکولوسیت‌های بالغ تر می‌توان تخریب میتوکندری، فشردگی هموگلوبین و وجود واکوئل‌های درون سلولی بیشتر حاوی مواد باقیمانده و وزیکول‌های برون سلولی را مشاهده کرد.

اهمیت بالینی گلبول قرمز نابالغ

رتیکولوسیت‌ها (reticulocyte) یک شاخص بالینی مفید برای کم خونی و پاسخ مغز استخوان به کم خونی هستند. شمارش رتیکولوسیت (گلبول قرمز نابالغ) در یک فرد سالم باید بین 0.5% تا 2.5% باشد. هنگامی که بیمار دچار کم خونی می‌شود و مغز استخوان قادر به پاسخ دادن نیست، شمارش رتیکولوسیت (گلبول قرمز نابالغ) کم خواهد بود. هنگامی که مغز استخوان بتواند به طور مناسب پاسخ دهد، تعداد رتیکولوسیت افزایش می‌یابد.

کاهش تعداد رتیکولوسیت (گلبول قرمز نابالغ) در بیماران می‌تواند ناشی از موارد زیر باشد:

• کم خونی هیپوکروم

کم خونی فقر آهن، کم خونی سیدروبلاستیک و کم خونی بیماری مزمن همگی از علل کاهش شمارش رتیکولوسیت (گلبول قرمز نابالغ) هستند زیرا منجر به کاهش سنتز هموگلوبین می‌شوند.

• آنمی آپلاستیک

این بیماری در پاسخ به نارسایی مغز استخوان، پان‌سیتوپنی است. در حالی که علل زیادی برای این بیماری وجود دارد، همه آنها اریتروپوئز را کاهش می‌دهند زیرا رتیکولوسیت‌ها (گلبول قرمز نابالغ) در مغز استخوان تشکیل می‌شوند.

• کمبود تغذیه

مقادیر ناکافی ویتامین B12 و فولات از علل کم خونی مگالوبلاستیک هستند. این مواد مغذی در مغز استخوان برای سنتز DNA لازم است و بدون آن تولید رتیکولوسیت کاهش می‌یابد.

• کم خونی آپلاستیک در کم خونی همولیتیک

کم خونی آپلاستیک کاهش کوتاه مدت اریتروپوئز به دلیل کاهش سلول بنیادین در مغز استخوان است. معمولا بدلیل عفونت مانند پاروویروس B19، سالمونلا و استرپتوکوک پنومونی است. بیماران مبتلا به کم خونی همولیتیک تعداد رتیکولوسیت بالایی دارند، بنابراین هنگامی که تعداد ان کم است، احتمالاً دچار کم خونی آپلاستیک می‌شوند.

• سندرم‌های میلودیسپلاستیک

این سندرم‌ها به طور مشخص آسیب مغز استخوان را به دلایل مختلف نشان می‌دهند. رده سلولی اریتروپوئیتیک معمولاً تحت تأثیر قرار می‌گیرد و مغز استخوان قادر به تولید رتیکولوسیت‌ها نیست.

علل افزایش تعداد رتیکولوسیت عبارتند از :

• کم خونی همولیتیک

این کم خونی‌ها نتیجه تخریب گلبول‌های قرمز خون هستند. مغز استخوان دارای عملکردی برای فراهم کردن اجزای مورد نیاز برای ایجاد رتیکولوسیت‌ها است و با افزایش سنتز رتیکولوسیت‌ها به کم خونی پاسخ می‌دهد.

• خونریزی

خونریزی حاد یا مزمن باعث افزایش اریتروپوئز می‌شود.

مطالعه مطالب بیشتر در رابطه با اختلالات خونی

تجزیه و تحلیل رتیکولوسیت، عمدتا کسر رتیکولوسیت نابالغ (IRF) نیز در بیماران شیمی درمانی مبتلا به لوسمی برای تعیین فعالیت احیا کننده مغز استخوان در طول و بعد از درمان استفاده شده است. همین ایده در مورد بیماران پیوند مغز استخوان نیز صدق می‌کند.

یکی دیگر از کاربردهای بالینی شمارش رتیکولوسیت در بیمارانی است که داروی هیدروکسی اوره را برای کم خونی داسی شکل مصرف می‌کنند. این دارو تولید رتیکولوسیت‌های مغز استخوان را مختل کرده، بنابراین باعث کاهش شمارش آنها می‌شود. به همین دلیل، شمارش مکرر رتیکولوسیت در هنگام مصرف این دارو ضروری است.

در بیماران کلیوی که تحت درمان اریتروپویتن قرار می‌گیرند، شمارش رتیکولوسیت پارامتری برای اندازه گیری درمان استفاده شده است.

مقادیر دیگر به غیر از شمارش رتیکولوسیت که می‌تواند برای ارزیابی عملکرد محاسبه شود:

• شاخص تولید رتیکولوسیت (RPI) = [%تعداد رتیکولوسیت x بیمار Hct]/45(هکت نرمال)

این یک شمارش رتیکولوسیت اصلاح شده است که در آنمی (کم خونی) استفاده می‌شود. در آنمی، شمارش رتیکولوسیت به صورت کاذب بالا میتواند رخ دهد. کاهش گلبول قرمز‌ها به طور خودکار تعداد رتیکولوسیت را افزایش می‌دهد حتی اگر اریتروپوئز رخ نداده باشد زیرا شمارش نشان دهنده درصد در مقایسه با گلبول قرمزها است. ممکن است افزایش مناسب اریتروپوئز در پاسخ به کم خونی رخ نداده باشد. بنابراین این مقدار برای این مسئله اصلاح می‌شود.

• مقدار رتیکولوسیت نابالغ (IRF): این مقدار رتیکولوسیت‌های نابالغ است که نسبت رتیکولوسیت‌های نابالغ به مقدار کل رتیکولوسیت‌ها اندازه گیری می‌شود.
• مقدار هموگلوبین رتیکولوسیت (Chr): اندازه گیری غیرمستقیم از کم خونی فقر آهن است. مقدار آهن استفاده شده‌ی موجود در مغز استخوان را که می‌تواند برای تولید هموگلوبین توسط رتیکولوسیت اندازه گیری می‌کند. مطالعات متعدد نشان داده است که مقدار هموگلوبین رتیکولوسیت کمتر از 28 pg بوده و پیش بینی کننده موثری برای کم خونی فقر آهن است.

منابع

1. Riley RS, Ben-Ezra JM, Goel R, Tidwell A. Reticulocytes and reticulocyte enumeration. J Clin Lab Anal. 2001;15(5):267-94. [PMC free article] [PubMed]
2. Piva E, Brugnara C, Spolaore F, Plebani M. Clinical utility of reticulocyte parameters. Clin Lab Med. 2015 Mar;35(1):133-63. [PubMed]
3. Moras M, Lefevre SD, Ostuni MA. From Erythroblasts to Mature Red Blood Cells: Organelle Clearance in Mammals. Front Physiol. 2017;8:1076. [PMC free article] [PubMed]
4. Noulin F, Borlon C, van den Eede P, Boel L, Verfaillie CM, D’Alessandro U, Erhart A. Cryopreserved reticulocytes derived from hematopoietic stem cells can be invaded by cryopreserved Plasmodium vivax isolates. PLoS One. 2012;7(7):e40798. [PMC free article] [PubMed]
5. Mast AE, Blinder MA, Dietzen DJ. Reticulocyte hemoglobin content. Am J Hematol. 2008 Apr;83(4):307-10. [PubMed]
6. Riley RS, Ben-Ezra JM, Tidwell A, Romagnoli G. Reticulocyte analysis by flow cytometry and other techniques. Hematol Oncol Clin North Am. 2002 Apr;16(2):373-420, vii. [PubMed]
7. Preloznik-Zupan I, Cernelc P, Zontar D. Reticulocyte analysis using light microscopy and two different flow cytometric procedures. Pflugers Arch. 2000;440(5 Suppl):R185-7. [PubMed]
8. Koury MJ, Koury ST, Kopsombut P, Bondurant MC. In vitro maturation of nascent reticulocytes to erythrocytes. Blood. 2005 Mar 01;105(5):2168-74. [PubMed]
9. Raja-Sabudin RZ, Othman A, Ahmed-Mohamed KA, Ithnin A, Alauddin H, Alias H, Abdul-Latif Z, Das S, Abdul-Wahid FS, Hussin NH. Immature reticulocyte fraction is an early predictor of bone marrow recovery post chemotherapy in patients with acute leukemia. Saudi Med J. 2014 Apr;35(4):346-9. [PubMed]
10. Agrawal RK, Patel RK, Shah V, Nainiwal L, Trivedi B. Hydroxyurea in sickle cell disease: drug review. Indian J Hematol Blood Transfus. 2014 Jun;30(2):91-6. [PMC free article] [PubMed]
11. Chang CC, Kass L. Clinical significance of immature reticulocyte fraction determined by automated reticulocyte counting. Am J Clin Pathol. 1997 Jul;108(1):69-73. [PubMed]
12. Karagülle M, Gündüz E, Sahin Mutlu F, Olga Akay M. Clinical significance of reticulocyte hemoglobin content in the diagnosis of iron deficiency anemia. Turk J Haematol. 2013 Jun;30(2):153-6. [PMC free article] [PubMed]